本試劑盒只供體外研究使用，不用于臨床診斷

猴死亡相關(guān)蛋白6(DAP6)酶聯(lián)免疫試劑盒    

本試劑盒用于體外定量檢測(cè)血清、血漿、組織勻漿等。

有效期：6 個(gè)月

保存條件：2-8℃

試劑盒組成：

備注：

1. （96T/48T）打開(kāi)包裝后請(qǐng)及時(shí)檢查所有物品是否齊全。

2. 標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次為：200、100、50、25、12.5、0 μg/mL

3. 經(jīng)過(guò)大量正常標(biāo)本檢驗(yàn)，標(biāo)本的正常濃度值均在試劑盒提 供的檢測(cè)范圍內(nèi)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中直接取 50μL 樣本上樣即可。 當(dāng)有部分樣本值超過(guò)最大標(biāo)準(zhǔn)品濃度時(shí)，可用樣本希釋液 將標(biāo)本進(jìn)行適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

檢測(cè)前準(zhǔn)備工作：

1. 請(qǐng)?zhí)崆?20 分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫。

2. 從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結(jié)晶，屬于正?，F(xiàn)象； 放置室溫，輕搖均勻，待結(jié)晶溶解后再配置洗滌液。 可將 20ml 濃縮洗滌液用蒸餾水或去離子水稀釋配置成 400ml 工作濃度的洗滌液，未用完的放回 4℃

3. 20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按 1：20 稀釋，即 1 份 20× 洗滌緩沖液加 19 份蒸餾水。

猴死亡相關(guān)蛋白6(DAP6)酶聯(lián)免疫試劑盒

實(shí)驗(yàn)原理：

試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) （ELISA）。往預(yù)先包被的包被微孔中，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP 標(biāo)記的檢測(cè)抗體，經(jīng)過(guò)溫育并洗滌。用底物 TMB顯色，TMB 在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成黃色。顏色的深淺和樣品呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在 450nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD 值），計(jì)算樣品濃度。

實(shí)驗(yàn)所需自備試驗(yàn)器材：

1. 酶標(biāo)儀（450nm）

2. 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、 200-1000uL

3. 37℃恒溫箱

4. 蒸餾水或去離子水

樣本處理及要求：

1. 血清：將收集于血清分離管的全血標(biāo)本在室溫放置 2 小時(shí) 或 4℃過(guò)夜，然后 1000×g 離心 20 分鐘，取上清即可，或 將上清置于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

2. 血漿：用 EDTA 或肝素作為抗凝劑采集標(biāo)本，并將標(biāo)本在 采集后的 30 分鐘內(nèi)于 2-8℃ 1000×g 離心 15 分鐘，取上 清即可檢測(cè)，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免 反復(fù)凍融。

3. 組織勻漿：用預(yù)冷的 PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除 殘留血液（勻漿中裂解的紅細(xì)胞會(huì)影響測(cè)量結(jié)果），稱重 后將組只剪碎。將剪碎的組織與對(duì)應(yīng)體積的 PBS（一般按 1:9 的重量體積比，比如 1g 的組織樣品對(duì)應(yīng) 9mL 的 PBS， 具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄。推薦在 PBS 中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充 分研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞，可以對(duì)勻漿液進(jìn)行超 聲破碎，或反復(fù)凍融。最后將勻漿液于 5000×g 離心 5~10 分鐘，取上清檢測(cè)。

4. 細(xì)胞培養(yǎng)物上清：請(qǐng) 1000×g 離心 20 分鐘，取上清即可檢 測(cè)，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

5. 其它生物標(biāo)本：1000×g 離心 20 分鐘，取上清即可檢測(cè)。

6. 樣品外觀：樣品應(yīng)清澈透明，懸浮物應(yīng)離心去除。

7. 樣品保存：樣品收集后若在 1 周內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)的可保存于 4℃，若不能及時(shí)檢測(cè)，請(qǐng)按一次使用量分裝，凍存于-20℃ （1 個(gè)月內(nèi)檢測(cè)），或-80℃（6 個(gè)月內(nèi)檢測(cè)），避免反復(fù)凍 融，標(biāo)本溶血會(huì)影響最后檢測(cè)結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn) 行此項(xiàng)檢測(cè)。

注意事項(xiàng)：

1. 嚴(yán)格按照規(guī)定的時(shí)間和溫度進(jìn)行溫育以保證準(zhǔn)確結(jié)果。所 有試劑都必須在使用前達(dá)到室溫 20-25℃。使用后立即冷 藏保存試劑。

2. 洗板不正確可以導(dǎo)致不準(zhǔn)確的結(jié)果。在加入底物前確保盡 量吸干孔內(nèi)液體。溫育過(guò)程中不要讓微孔干燥掉。

3. 消除板底殘留的液體和手指印，否則影響 OD 值。

4. 底物顯色液應(yīng)呈無(wú)色或很淺的顏色，已經(jīng)變藍(lán)的底物液不 能使用。

5. 避免試劑和標(biāo)本的交叉污染以免造成錯(cuò)誤結(jié)果。

6. 在儲(chǔ)存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射。

7. 平衡至室溫后再打開(kāi)密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。

8. 任何反應(yīng)試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強(qiáng) 烈氣體。任何漂白成分都會(huì)破壞試劑盒中反應(yīng)試劑的生物 活性。

9. 不能使用過(guò)期產(chǎn)品。

10. 如果可能傳播疾病，所有的樣品都應(yīng)管理好，按照規(guī)定的 程序處理樣品和檢測(cè)裝置。

操作步驟：

1．從室溫平衡 60min 后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板 條用自封袋密封放回 4℃。

2．設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn) 品 50μL。

3．樣本孔中加入待測(cè)樣本 50μL；空白孔不加。樣本不足， 或者樣本濃度過(guò)高，可用樣本希釋液做稀釋。

4. 除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過(guò)氧化 物酶（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗體 100μL，用封板膜封住反應(yīng) 孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育 60min。

5．棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL）， 靜置 1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板 5 次（也可用洗板機(jī)洗板）。

6. 每孔加入底物 A、B 各 50μL，37℃避光孵育 15min。

7. 每孔加入終止液 50μL，15min 內(nèi)，在 450nm 波長(zhǎng)處 測(cè)定各孔的 OD 值。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算：

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：以所測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的 OD 值為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品的濃 度值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上或用相關(guān)軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得 到直線回歸方程，將樣品的 OD 值代入方程，計(jì)算出樣品的濃 度。

試劑盒性能：

1. 檢測(cè)范圍：1.32 μg/mL –200 μg/mL。

2. 靈敏度：檢測(cè)濃度小于 0.78 μg/mL。

3. 特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。

4. 重復(fù)性：板內(nèi)變異系數(shù)小于 10% ，板間變異系數(shù)小于 15% 。

技術(shù)小提示：

1. 當(dāng)混合或重溶蛋白溶液時(shí)，盡量避免起沫。

2. 為了避免交叉感染，配置不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品、上樣、加不同 試劑都需要更換槍頭。另外不同試劑請(qǐng)分別使用不同的移 液槽。

3. 每次孵育時(shí)，請(qǐng)正確使用封板膠可保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

4. 混合后的顯色底物在上板前應(yīng)為無(wú)色，請(qǐng)避光保存；假如 微孔板后，將由物色變成不同深度的藍(lán)色。

5. 終止液上板順序應(yīng)同顯色底物上板順序一致；加入終止液 后，孔內(nèi)顏色由藍(lán)變黃；若孔內(nèi)有綠色，則表明孔內(nèi)液體 未混勻；請(qǐng)充分混合。

說(shuō)明：

1. 由于現(xiàn)有條件及科學(xué)技術(shù)水平尚不能對(duì)所有供貨商提供 的所有原料進(jìn)行全面的鑒定與分析，本產(chǎn)品可能存在一定 的質(zhì)量技術(shù)風(fēng)險(xiǎn)。

2. 最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與試劑的有效性、實(shí)驗(yàn)者的相關(guān)操作以及 當(dāng)時(shí)的實(shí)驗(yàn)環(huán)境密切相關(guān)，請(qǐng)務(wù)必準(zhǔn)備充足的標(biāo)本備份。

3. 不同批次的同一產(chǎn)品可能會(huì)有少許差別，如：檢測(cè)限、靈 敏度以及顯色時(shí)間等，請(qǐng)依據(jù)試劑盒內(nèi)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操 作，網(wǎng)站電子版說(shuō)明書(shū)僅作參考。

4. 只有全部使用本試劑盒配套試劑才能保證檢測(cè)效果，不能 混用其他制造商的產(chǎn)品。只有嚴(yán)格遵守本試劑盒的實(shí)驗(yàn)說(shuō) 明才會(huì)得到最佳的檢測(cè)結(jié)果。

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