硝酸還原酶(NR)測試盒（NADH速率法）

本品用于科研實(shí)驗(yàn),不用于臨床。

如何處理ELISA測定抗體疫苗的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)？

在ELISA試劑盒試驗(yàn)中我們總是碰到許多關(guān)于數(shù)據(jù)處理的難題，為了能我們更多更具體的了解在試驗(yàn)中數(shù)據(jù)處理的問題，下面一起來看看ELISA測定抗體之怎么處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

ELISA做得很好的話批間CV都要有10～15％左右，用同一個抗原，但對于包被的抗原濃度對OD的影響不是很大，只要不是不同太大即可?？寡瀹?dāng)然要用同一個稀釋度了。別的比較的話就必每批，每塊板上的樣品都要伴隨著一個參比品一同做，參比品仍是同一個這樣才干確保試驗(yàn)成果的可比性。

剖析：

（1）將同一只動物免疫不同時(shí)刻后抗體產(chǎn)生的效價(jià)進(jìn)行比較。

（2）由上面能夠得出一組數(shù)據(jù)，舉個比如即如某個免疫間期抗體升高2倍的有多少，升高4，8，16...的各有多少，然后可知大多數(shù)情況下可升高多少，即此種升高率的陽性率，然后再用泊松散布證明此陽性率是否贊同整體在這個免疫間期增高的陽性率，仍是由于隨機(jī)誤差的原因使試驗(yàn)得到了這個成果。

（3）計(jì)算出不同間期的效價(jià)水平后，能夠用方差剖析進(jìn)行整體比較，證明不同間期免疫的作用差異是否有計(jì)算學(xué)含義；然后再兩兩之間進(jìn)行比較，看免疫作用*顯著的是哪個間期。

ELISA試劑盒酶標(biāo)板在什么情況下會失效？

       ELISA試劑盒的保質(zhì)期一般都是在一年，如果保存妥當(dāng)?shù)脑?，不會出現(xiàn)問題的。但不要重復(fù)凍融。當(dāng)然如果是正常的DAS-ELISA檢測試劑盒等，應(yīng)該放在4℃左右冰箱保存。主張ELISA試劑盒凍結(jié)后一次用完。已開封或許運(yùn)用后，剩下試劑仍需依照試劑瓶標(biāo)簽所示的溫度保存，ELISA檢測試劑盒開封后的酶標(biāo)板要加干燥劑后密封保存于-20℃，防止?jié)駶櫋?/span>

       但要留意的是，如果將ELISA試劑盒剛從冰箱里邊拿出來就當(dāng)即運(yùn)用的話，可能會影響，其直接的后果是對一些弱陽性標(biāo)本的檢測出現(xiàn)假陰性。

       主張：先從冰箱中拿出來，在室溫下放置20分鐘以上后，再進(jìn)行測定，以使試劑盒在ELISA檢測試劑盒運(yùn)用前與室溫平衡。這樣做的意圖，首要是為了在后面的溫育反響過程中，能使反響微孔內(nèi)的溫度能較快地到達(dá)所要求的高度，以滿意測定要求。

試劑盒規(guī)格中是100管和50管是什么意思?

(1)50管/48樣:50管指能夠做50次測定,48樣指可以測試48個樣品。如果每個樣品重復(fù)測定3次,那么只能測定16個樣品。其中有2次測定用于

空白管或者對照管。值得特別注意的是,50管/24樣中由于每個樣品測定都需要做對照,因此能夠測定樣品的數(shù)量僅為8個(假設(shè)做3次重復(fù))

(2)100管/96樣:100管指能夠做100次測定,96樣指可以測定96個樣品,如果每個樣品重復(fù)測定3次,那么只能測定32個樣品。其中有4次測定用

于空白管或者對照管。注意由于瓶璧和移液器吸附等,通常要比理論測定次數(shù)少1~3次。其它規(guī)格的含義依次類推。值得特別注意的是,100

管/48樣中由于每個樣品測定都需要做對照,因此能夠測定樣品的數(shù)量僅為16個(假設(shè)做3次重復(fù))。

如何防止試劑盒失效?

  不要過早訂購,以免試劑盒失效.收到試劑盒后,檢查外包裝是否正常。馬上打開,按照試劑盒說明書核對試劑數(shù)量是否正確,注意瓶中試劑狀態(tài)是否與說明書一致。如果有問題,或者懷疑,馬上聯(lián)系公司銷售,進(jìn)行確認(rèn)。如果沒有問題,請務(wù)必按照說明書進(jìn)行試劑的保存。注意,不同試劑,可能需要分別保存在常溫(25°℃)、4℃和-20℃,務(wù)必分別按照要求保存,不要整個試劑盒放置于冰箱。

如何進(jìn)行預(yù)測定?

(1)務(wù)必在7個工作日內(nèi)進(jìn)行預(yù)測定,以確定該試劑盒是否適合您的樣品,以免造成試劑盒和樣品的浪費(fèi)。

(2)選擇2~3個預(yù)期差異比較大的樣品,嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作,注意儀器工作狀態(tài),操作規(guī)范,控制好測定條件,尤其是溫度。

(3)如實(shí)與公司銷售溝通預(yù)測定結(jié)果,公司技術(shù)人員會確認(rèn)測定結(jié)果是否正常,是否需要調(diào)整,如何進(jìn)行調(diào)整,從而確保您的測定結(jié)果可靠。

熒 光 分 析 法

      熒光分析法是指利用某些物質(zhì)被紫外光照射后處于激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)分子經(jīng)歷一個碰撞及發(fā)射的去激發(fā)過程所發(fā)生的能反映出該物質(zhì)特性的熒光，可以進(jìn)行定性或定量分析的方法。由于有些物質(zhì)本身不發(fā)射熒光（或熒光很弱），這就需要把不發(fā)射熒光的物質(zhì)轉(zhuǎn)化成能發(fā)射熒光的物質(zhì)。例如用某些試劑（如熒光染料），使其與不發(fā)射熒光的物質(zhì)生成絡(luò)合物，各種絡(luò)合物能發(fā)射熒光，再進(jìn)行測定。因此熒光試劑的使用，對一些原來不發(fā)熒光的無機(jī)物質(zhì)和有機(jī)物質(zhì)進(jìn)行熒光分析打開了大門，擴(kuò)展了分析的范圍。

比色皿有哪些規(guī)格?

(1)常量比色皿,如1mL和3mL等,常量法試劑盒都是選用1mL體系,只能用1mL比色皿,不可以用更大體積的比色皿,否則試劑量不夠,無法正常比色。

(2)微量比色皿,如0.25mL和0.5mL等,微量法試劑盒都是選用0.25mL比色皿。一般客戶都選擇使用標(biāo)儀(需要自備酶標(biāo)板)

(3)紫外波長檢測需要石英比色皿,不可以用普通玻璃比色皿。

(4)不同規(guī)格的比色皿,其外觀大小是一致的,都是1cm光徑(也有0.5cm光徑的比色皿,不常見,也可以用,但是計(jì)算時(shí)要注意修改計(jì)算公式),其內(nèi)

容積差異在于壁的厚度。

代測的優(yōu)點(diǎn)

(1)更加省事兒,不必為測定犯難。用戶只要提供樣品和想測定的指標(biāo),就不再需要為測定操心了,不再受到操作技能、儀器設(shè)備和時(shí)間

的限制,就等著拿到數(shù)據(jù)寫論文。

(2)測定數(shù)據(jù)更有保障。嚴(yán)格的測定質(zhì)量管理體系,從而保證了測定結(jié)果的真實(shí)可靠。我們還建立了定制度。

(3)防止樣品損失無論是用戶自己完成測定全過程,還是購買試劑盒完成測定,都可能因?yàn)槿狈y定經(jīng)驗(yàn),導(dǎo)致測定失敗,從而損失樣品的情況。對于生命科學(xué)研究而言,樣品是最珍貴的。樣品一旦損失,輕則造成研究進(jìn)度被耽擱,重則造成研究失敗!代測能夠充分保證測定成功,從而防止了樣品損失。當(dāng)然,樣品質(zhì)量是測定成功的前提,而且樣品質(zhì)量只有用戶自己才能控制和保證。

生化檢測試劑盒的基本原理

生化檢測試劑盒,又稱生化試劑盒,是利用特定的生物成分、動力學(xué)及化學(xué)反應(yīng)等技術(shù)制備的試劑盒,用于檢測生理學(xué)、病理學(xué)、藥理學(xué)等領(lǐng)域中特定的生物分子或化學(xué)物質(zhì)。生化檢測試劑盒包括底物、酶試劑盒、探針等多個組成部分,其中的是底物-酶法。

底物-酶法是生化檢測試劑盒檢測的基本原理。在該過程中,底物與酶在細(xì)胞膜上結(jié)合形成基質(zhì)酶,進(jìn)而形成底物-酶復(fù)合物。隨著時(shí)間的推

移,底物-酶復(fù)合物逐漸分解,釋放出分子小的底物和分子大的未消化的底物。未消化的底物可以被一系列的酶代謝,同時(shí)底物、酶和代謝產(chǎn)物都會對復(fù)合物的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響,從而影響檢測試劑盒的檢測結(jié)果。

生化試劑盒可以檢測的樣本類型有哪些?

 生化試劑盒的實(shí)驗(yàn)原理是基于化學(xué)反應(yīng),理論上是不受生物種屬及樣本類型的限制。生化試劑盒樣本檢測通常只分樣本類型,不分種屬。但是某些指標(biāo)在不同種屬或類型樣本中的提取方式不同。因此,具體情況請參見說明書或與技術(shù)支持聯(lián)系確認(rèn)。

生化試劑盒樣本檢測的一般要求:

1)于生化檢測而言,樣本最-好無溶血、脂血、黃-疸的現(xiàn)象。組織樣本需將血液洗凈擦干后再進(jìn)行稱重處理。

2)樣本處理后最-好盡快進(jìn)行檢測,且保存于冰盒之上,待測。

3)樣本需澄清,若不澄清,需離心后取上清進(jìn)行檢測(特殊指標(biāo)除外)。

4)樣本值應(yīng)在試劑盒線性范圍內(nèi),若超過線性范圍,需稀釋后再進(jìn)行檢測,若低于檢測范圍,需增加樣本濃度后進(jìn)行檢測。

微 量 分 析 法  

     微量分析(Microanalysis)在化學(xué)分析中，其試樣重量為1-10mg的化學(xué)分析方法稱為微量分析。有微量定性分析和微量定量分析之分，定性常采用點(diǎn)滴反應(yīng)和顯微結(jié)晶反應(yīng)等靈敏度較高的分析方法，定量分析常用重量、容量及儀器等分析方法。在以試樣重量不同的分析分類中還有半微量分析和超微量分析等。

培養(yǎng)基的防霉以及霉后的處理方法

防霉辦法

1、培育果蠅的器皿要嚴(yán)格消毒。培育瓶洗潔凈后，自然涼干，再與棉塞一道進(jìn)行高溫枯燥滅菌(120℃，30min) 。

2、養(yǎng)分要全面。種類許多，本實(shí)驗(yàn)室用的是玉米培育基。

配方：

水750mL煮開，加瓊脂6.2g，待瓊脂溶解后加白糖62.5g，拌和溶解后加調(diào)成糊狀的玉米糊，煮開2～3min，加酵母粉7g，加熱1～2min，拌和均勻后，移去火源，加丙酸2mL。培育基稍稍冷卻后，倒入已滅菌的瓶中，盡量不要粘在瓶壁上，塞好棉塞，放入仍有余熱的枯燥箱中將瓶壁上的水蒸干。

3、接種時(shí)消好毒。在無菌室內(nèi)接種，如沒有無菌室，在接種前用75%酒精棉球擦雙手一遍。接種后，放入適宜果蠅成長溫度的培育箱中培育果蠅(溫度20～25℃)，一旦下一代成蠅孵出來后，這樣就就不易長霉啦。

培育基的霉后處理辦法

由于霉菌孢子漂浮于培育瓶的整個空間，包括果蠅身上，如將此果蠅接種到新的里邊，大約經(jīng)過4 ～5d，培育基將會重新長出霉菌來。遇到該問題，解決的辦法只要兩種：① 不再接種這種長霉菌果蠅，重新接種未長霉的果蠅；② 采取辦法殺死果蠅身上的霉菌孢子。

殺霉菌辦法：

將帶有霉菌孢子的成蠅倒入空培育瓶中，棉塞上倒適量的75%酒精，再將瓶口塞緊，使用酒精具有蒸發(fā)性，蒸發(fā)后的酒精充滿整個瓶內(nèi)，從而將果蠅身上的霉孢子殺死。

上海酶聯(lián)生物提醒注意：

1、倒在棉塞上的酒精量要適宜，過多果蠅易醉昏，過少殺死不了霉菌孢子；

2、果蠅呆在空瓶內(nèi)的時(shí)間要恰當(dāng)，以2d為好。

硝酸還原酶(NR)測試盒（NADH速率法）

本品用于科研實(shí)驗(yàn),不用于臨床。

測定意義:

輔酶NAD(H)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,NAD+是糖酵解(EMP)和三羧酸循環(huán)(TCA)的主要?dú)涫荏w,生成的 NADH 經(jīng)呼吸電子鏈(ETC)傳遞把電子交給氧,在合成 ATP 的同時(shí),形成大量的 ROS,同時(shí) NADH 再生為 NAD+。糖、脂、蛋白質(zhì)三大代謝物質(zhì)分解中的氧化反應(yīng)絕大部分通過這一體系完成。NAD(H)含量和 NADH/NAD+比值的高低可用于評價(jià)糖酵解和 TCA 循環(huán)的強(qiáng)弱。較高的NAD(H)及 NADH/NAD+比值說明細(xì)胞呼吸耗氧量較高,處于過氧化狀態(tài)。此外,NADH/NAD+比值升高也可抑制糖酵解和 TCA 循環(huán)。另外,NAD+降解產(chǎn)物對細(xì)胞信號傳導(dǎo)、代謝和基因表達(dá)等具有重要的調(diào)控作用。

測定原理:

分別用酸性和堿性提取液提取樣品中 NAD+和 NADH,NADH 通過 PMS 的遞氫作用,還原氧化型噻唑藍(lán)(MTT)為甲瓚,在 570nm 下檢測吸光值;而 NAD+可被乙醇脫氫酶還原為 NADH,進(jìn)一步采用 MTT 還原法檢測。

需自備的儀器和用品:

酶標(biāo)儀、臺式離心機(jī)、移液器、96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制:

酸性提取液:液體 50mL×1 瓶,4℃保存;

堿性提取液:液體 50mL×1 瓶,4℃保存;

試劑一:液體 10 mL×1 瓶,4℃保存;

試劑二:液體 3 mL×1 瓶,4℃保存;

試劑三:粉劑×1 瓶,-20 ℃保存,用時(shí)加入 3mL 蒸餾水,混勻,用不完的試劑 4℃保存一周;

試劑四:粉劑×1 瓶,4 ℃保存,用時(shí)加入 3mL 蒸餾水,混勻,用不完的試劑 4℃保存一周;

試劑五:液體 3.6mL×1 瓶,4 ℃保存;

試劑六:液體 30mL×1 瓶,4 ℃保存;

試劑七:液體 50mL×1 瓶,4 ℃保存。

NAD+和 NADH 的提取:

1 血清(漿)中 NAD+和 NADH 的提取:

NAD+的提取:按照血清(漿)體積(mL):酸性提取液體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議取約 0.1mL 血清(漿),加入 1mL 酸性提取液),95℃水浴 5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 ℃離心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 堿性提取液使之中和,混勻,10000g 4 ℃離心 10min,取上清,置冰上待測。

NADH 的提取:按照血清(漿)體積(mL):堿性提取液體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議取約 0.1mL血清(漿),加入 1mL 堿性提取液),95℃水浴 5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 ℃離心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 酸性提取液使之中和,混勻,10000g 4 ℃離心 10min,取上清,置冰上待測。

2 組織中 NAD+和 NADH 的提取:

NAD+的提取:按照組織質(zhì)量(g):酸性提取液體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議取約 0.1g 組織,加入 1mL酸性提取液),冰浴研磨,95℃水浴 5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 ℃離心10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 堿性提取液使之中和,混勻,10000g 4 ℃離心 10min,取上清,置冰上待測。

NADH 的提取:按照組織質(zhì)量(g):堿性提取液體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議取約 0.1g 組織,加入 1mL堿性提取液),冰浴研磨,95℃水浴 5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 ℃離心10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 酸性提取液使之中和,混勻,10000g 4 ℃離心 10min,取上清,置冰上待測。

3 細(xì)胞或細(xì)菌中 NAD+和 NADH 的提取:

NAD+的提取:先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi),棄上清,按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104 個):酸性提取液體積(mL)為 500~1000:1 的比例(建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 酸性提取液),超聲波破碎(冰浴,功率20%或 200W,超聲 3s,間隔 10s,重復(fù) 30 次),95℃水浴 5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 ℃離心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 堿性提取液使之中和,混勻,10000g 4 ℃離心

10min,取上清,置冰上待測。NADH 的提取:先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi),棄上清,按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104 個):堿性提取液體積(mL)為 500~1000:1 的比例(建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 堿性提取液),超聲波破碎(冰浴,功率20%或 200W,超聲 3s,間隔 10s,重復(fù) 30 次),95℃水浴 5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 ℃離心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 酸性提取液使之中和,混勻,10000g 4 ℃離心10min,取上清,置冰上待測。

充分混勻,靜置 5min 后,20000g,25℃離心 5min,棄上清,沉淀中加入:

混勻,取 200μL 轉(zhuǎn)移至微量石英比色皿或 96 孔板中,570nm 下讀取對照吸光值 A1 和測定管吸光值 A2,計(jì)算△A=A2-A1。

注意事項(xiàng):

1、如果一次性測定樣本數(shù)較多,可將試劑一、二、三和四按比例配成混合液。

2、對照管和測定管的測定步驟的區(qū)別:對照管加完試劑一、二、三、四和五后必須馬上加試劑六;測定管加完試劑一、二、三、四和五后必須反應(yīng) 20min 后再加試劑六。

3、反應(yīng)過程中注意避光。

4、若 NAD+測定中△A(A2-A1)≤0.0302,NADH 測定中△A(A2-A1)≤0.0222,說明樣本中輔酶含量較低,已低于檢測限,可做如下調(diào)整:(1)將測定管避光靜置時(shí)間 20min 延長到 60min;(2)在提取階段增加取樣量,即取 0.2g 樣本或 0.2mL 樣本加入 1mL 提取液。

5、由于每一個測定管需要設(shè)一個對照管,本試劑盒 100 管保證測 48 個 NAD+或 NADH.

NAD+和 NADH 含量的計(jì)算:

(一) NAD+含量的計(jì)算

標(biāo)準(zhǔn)條件下的回歸曲線為 y = 0.1475x + 0.0302,R2 = 0.9978;其中 y 為△A,x 為 NAD+濃度 nmol/mL

1、血清(漿)中 NAD+含量計(jì)算

NAD+含量(nmol/mL)=[(△A -0.0302)÷0.1475×V1) ]÷(V3×V1÷V2)=135.6×(△A -0.0302)

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 NAD+含量計(jì)算

(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算

NAD+(nmol/mg prot)=[(△A -0.0302)÷0.1475×V1)]÷(V1×Cpr)= 6.8×(△A -0.0302)÷Cpr

(2)按樣本鮮重計(jì)算

NAD+(nmol/g 鮮重)= [(△A -0.0302)÷0.1475×V1)]÷(W×V1÷V2)= 13.6×(△A -0.0302)÷W

(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

NAD+(nmol/104 cell)=[(△A -0.0302)÷0.1475×V1)]÷(500×V1÷V2)=0.027×(△A -0.0302)

(二)NADH 含量的計(jì)算

標(biāo)準(zhǔn)條件下的回歸曲線為 y = 0.1404x + 0.0222,R2 = 0.9976;其中 y 為△A,x 為 NADH 濃度 nmol/mL

1、血清(漿)中 NADH 含量計(jì)算

NADH 含量(nmol/mL)= [ (△A -0.0222)÷0.1404×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 142.5×(△A -0.0222)

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 NADH 含量計(jì)算

(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算

NADH (nmol/mg prot)= [ (△A -0.0222)÷0.1404×V1) ]÷(V1×Cpr)= 7.1×(△A -0.0222)÷Cpr

(2)按樣本鮮重計(jì)算

NADH (nmol/g 鮮重)=[(△A -0.0222)÷0.1404×V1) ]÷(W×V1÷V2)= 14.2×(△A -0.0222)÷W

(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

NADH (nmol/104 cell)= [ (△A -0.0222)÷0.1404×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.028×(△A -0.0222)

V1:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.02mL;V2:加入提取液體積,2mL;V3:加入血清(漿)體積:0.1mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL; W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500 萬。

注 意: 檢測限為 0.1nmol/mL 或 0.1nmol/g 鮮重 或 0.001nmol/mg prot