?；D(zhuǎn)移酶（AAT）測試盒/微量法

??測定方法:分光光度法

??保存條件:低溫避光保存

??注 意:正式測定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

??CS(EC 2.3.3.1)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體基質(zhì)中,是三羧酸循環(huán)個(gè)限速酶,是三羧酸循環(huán)主要調(diào)控位點(diǎn)之一。

??CS 催化乙酰 CoA 和草酰乙酸產(chǎn)生檸檬酰輔meiA,進(jìn)一步水解產(chǎn)生檸檬酸;該反應(yīng)促使無色的 DTNB 轉(zhuǎn)變成的 TNB,在 412nm 處有特征吸光值。

??可見分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰、無水乙醇和蒸餾水。

??試劑一:液體 25mL×1 瓶,-20℃保存；

??試劑三:液體 0.5mL×1 支,-20℃保存；

??試劑五:粉劑×1 瓶,4℃保存。

?；D(zhuǎn)移酶（AAT）測試盒/微量法樣本的前處理:

??①稱取約 0.1g 組織或收集 500 萬細(xì)胞,加入 1mL 試劑一和 10uL 試劑三,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

??③棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,10g,4℃離心 10min。

??⑤在步驟④的沉淀中加入 200uL 試劑二和 2uL 試劑三,超聲波破碎(冰浴,功率 20%或200W,超聲 3 秒,間隔 10 秒,重復(fù) 30 次),用于線粒體 CS 測定。

??分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上,調(diào)節(jié)波長至 412nm,蒸餾水調(diào)零。

??(1)在試劑五中加入 0.6mL 無水乙醇和 13mL 試劑四,混勻,37℃(哺乳動(dòng)物)或 25℃(其

??(2)測定管:在 EP 管中加入 40μL 樣本、880μL 試劑五和 40μL 試劑六,混勻,37℃反應(yīng) 15min 后立即測定吸光值 A1。

??(3)計(jì)算 ΔA=A1-A2,每個(gè)測定管設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

CS 活性計(jì)算:

??單位的定義:每 mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol TNB 定義為一個(gè)酶活力單位。CS(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V 反總÷(ε×d)×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=117.6×ΔA÷Cpr

??(4)按樣本鮮重計(jì)算:

??CS(nmol/min /g 鮮重)=[ΔA×V 反總÷(ε×d)×109]÷(W× V 樣÷V 樣總)÷T=23.8×ΔA÷W(3)

??單位的定義:每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol TNB 定義為一個(gè)酶活力單位。CS(nmol/min /104 cell)=[ΔA×V 反總÷(ε×d)×109]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=0.0475×ΔA V 反總:反應(yīng)體系總體積,9.6×10-4 L;ε:TNB 摩爾消光系數(shù),1.36×104 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V 樣:加入樣本體積,0.04 mL;V 樣總:加入提取液體積,0.202 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,2 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500 萬。

相關(guān)產(chǎn)品: